第四節(jié) 燒傷濕性醫(yī)療技術對表皮再生干細胞作用的研究報告

［摘要］ 目的：探索燒傷濕性醫(yī)療技術于淺Ⅲ度燒傷時脂肪層燒傷創(chuàng)面自然修復的機制。方法：應用細胞免疫化學方法生物素－抗生物素蛋白(biotin-avidin)DCS體系間接免疫熒光技術。以小鼠抗人角蛋白19的單克隆抗體檢測表皮再生干細胞。結果：燒傷后24h可見表皮再生干細胞出現(xiàn)。燒傷后4天表皮再生干細胞數(shù)量增多。

燒傷后7天和14天表皮再生干細胞數(shù)量最多。燒傷后21天和28天表皮再生干細胞減少。結論：燒傷濕性醫(yī)療技術對淺Ⅲ度燒傷殘余組織中的再生表皮干細胞具有促進其激活和增生的作用。

［關鍵詞］ 燒傷 濕性醫(yī)療技術 表皮干細胞 細胞免疫化學

燒傷濕性醫(yī)療技術是燒傷治療學上的具有創(chuàng)新性的治療學術體系。目前已成功并普及推廣的治療技術為燒傷濕潤暴露療法與濕潤燒傷膏。在臨床上成功地解決了燒傷創(chuàng)面的疼痛、創(chuàng)面感染、創(chuàng)面的進行性壞死、燒傷深Ⅱ度創(chuàng)面的瘢痕愈合等四大國際燒傷難題。最近又取得了在Ⅲ度燒傷創(chuàng)面脂肪組織上再生皮膚的成果。深Ⅱ度燒傷和淺Ⅲ度燒傷使損傷的皮膚不再存留表皮基底層的干細胞。因此，使脂肪層燒傷創(chuàng)面自然修復的表皮再生干細胞的來源確實是值得深入研究的。

材 料 與 方 法

1. 取材 以下2例患者受傷后立即采用燒傷濕性醫(yī)療技術治療。

第1例：6歲男孩，熱水燙傷，背部、雙下肢。燙傷面積達33%。深Ⅱ度燙傷。

第2例：24歲男性青年，火焰燒傷四肢。燒傷面積25%，深Ⅱ度、淺Ⅲ度燒傷。

以上2例于正常部位及傷后24h、4天、7天、14天、21天、28天患處取皮膚或組織，立即放入凍存管于液氮中保存。然后放入OCT冷凍劑復合物(Tissue-Tek OCT Compound)中包埋，于液氮中冷凍。恒冷箱冰凍切片，厚度10祄。

2. 生物素—抗生物素蛋白DCS體系間接免疫熒光染色 先將冰凍切片用10%的馬血清于4℃孵育20min，然后滴加1:20稀釋的小鼠抗人角蛋白19型單克隆抗體（第1抗體）4℃孵育過夜。切片在磷酸緩沖液中涮洗后加第2抗體，即7.5礸/ml生物素化的馬抗小鼠IgG抗體(Vector Laboratories Burlingame, CA, USA)，4℃孵育1h。涮洗后，加10礸/ml熒光素-抗生物素蛋白DCS(Vector Laboratories Burlingame, CA, USA)于4℃孵育1h。將切片涮洗干凈后，用含10%PBS和1%對苯基二胺(P-phenylenediamine)的甘油做介質封片。對照染色切片，則不加第1抗體。標本在Olympus反射式熒光顯微鏡下觀察，并用ASA400 KODAK膠卷照相。

結 果

用特異的小鼠抗人角蛋白19型的單克隆抗體(McAb)對正常和燒傷皮膚免疫細胞化學觀察結果表明，兩例正常皮膚表皮再生干細胞數(shù)量較少，可見少量顯示熒光的表皮細胞再生干細胞（圖5-4-1），即角蛋白19型陽性細胞。燒傷后24h，熒光顯微鏡下，顯示熒光的表皮再生干細胞數(shù)量中等程度（圖5-4-2），燒傷后4天，在汗腺、毛細血管和毛囊周圍可見開始增多的潛在表皮干細胞（圖5-4-3）。

燒傷后7天（圖5-4-4）,燒傷后14天（圖5-4-5），在該兩時間點鏡下可見比燒傷后4天繼續(xù)增多的表皮再生干細胞。潛在的再生干細胞即含人角蛋白19型細胞的數(shù)量達到燒傷療程中的峰值（數(shù)量最多）。至燒傷后21天（圖5-4-6）和28天（圖5-4-7）兩時間點潛在再生干細胞數(shù)量又減至一定的水平。觀察中發(fā)現(xiàn)患者經(jīng)濕性燒傷醫(yī)療技術治療后，潛在再生干細胞的增生狀態(tài)有一定的變化規(guī)律。潛在再生干細胞可能是表皮再生的干細胞的來源，這些在熒光顯微鏡下顯示熒光的細胞是深Ⅱ度和淺Ⅲ度燒傷后還存在的潛在的表皮再生干細胞。這些細胞可使燒傷濕性醫(yī)療技術治療的深Ⅱ度燒傷無瘢痕愈合，淺Ⅲ度燒傷皮膚再生。

討 論

國際上對細胞周期的深入研究表明，細胞周期與生理性再生、創(chuàng)傷修復有密切的關系。有些細胞長期停滯于G0期或G1期，在一定條件下才出現(xiàn)增生活動。有些細胞可持續(xù)進行分裂活動，分裂后的部分子細胞分化為執(zhí)行一定功能的成熟細胞，部分子細胞則一直保持連續(xù)增生能力，稱干細胞。皮膚表皮基底層干細胞可不斷進行分裂，新生的細胞向上方移動，在到達棘層深部時可再分裂二或三次，然后失去細胞分裂能力。

深Ⅱ度和淺Ⅲ度燒傷損傷了皮膚表皮和真皮深層，表皮基底層的干細胞全部受到破壞。殘存于皮下組織的毛囊、汗腺，以及毛細血管周圍的間充質細胞都有可能提供表皮再生的干細胞。由于這些再生干細胞能合成特有的細胞角蛋白(19型)，所以可采用免疫細胞化學方法辨認這些細胞。我們的研究采用了抗人角蛋白19型單克隆抗體，應用生物素－抗生物素蛋白DCS體系間接免疫熒光技術，能夠準確、特異地檢測出深Ⅱ度和淺Ⅲ度燒傷后殘存于皮下組織的表皮再生干細胞。經(jīng)過燒傷濕性醫(yī)療技術治療后，于燒傷后7天至14天階段，潛在的再生干細胞即顯示人角蛋白19型免疫組織化學標志物的細胞數(shù)量達到峰值。這些顯示間接免疫熒光的細胞就是供脂肪層燒傷創(chuàng)面自然修復的表皮再生干細胞。由于燒傷濕潤暴露療法與濕潤燒傷膏的治療作用，可能激活了休眠狀態(tài)的潛在的表皮再生干細胞的增生。這有力地保證了深Ⅱ度或淺Ⅲ度燒傷，經(jīng)燒傷濕性醫(yī)療技術治療后，達到燒傷創(chuàng)面自然修復、無瘢痕愈合的療效。該技術解除了燒傷患者的瘢痕伴隨終生的痛苦。

表皮再生干細胞在移動和進行細胞分裂后，發(fā)生合成其他類型角蛋白(9型和16型）的細胞，這些細胞仍有移動能力。然后，它們分裂增生成的細胞合成較硬的角蛋白(1型和10型），這是成熟的表皮細胞所含的典型角蛋白。由此體現(xiàn)了燒傷濕性醫(yī)療技術對表皮再生干細胞具有促進其激活和增生的作用。

研究表明細胞從靜止期釋放出來，首先被激活的周期蛋白就是cyclin D，只有受到生長因子刺激后，它才表達。真核細胞生物在細胞的G1期決定進入增生狀態(tài)還是退出周期。G1期限制點的主要調(diào)控者是cyclin D1/CDK4復合體。為了深入研究燒傷濕性醫(yī)療技術療效作用機制，我們將進一步探索表皮再生干細胞細胞周期的基因調(diào)控。

圖5-4-1 正常皮膚、未見角蛋白19型陽性細胞  ×200

圖5-4-2 經(jīng)MEBT/MEBO治療燒傷后 24h，可見中等程度蛋白19型陽性細胞   ×200

圖5-4-3經(jīng)MEBT/MEBO治療燒傷后4天，角蛋白19型陽性細胞增多  ×200

圖5-4-4 經(jīng)MEBT/MEBO治療，燒傷后7天，角蛋白19型陽性細胞數(shù)量達峰值  ×200

圖5-4-5 經(jīng)MEBT/MEBO治療，燒傷后14天，角質蛋白19型陽性細胞數(shù)量達峰值  ×200

圖5-4-6 經(jīng)MEBT/MEBO治療，燒傷后21天，角蛋白19型陽性細胞減少  ×200

圖5-4-7 經(jīng)MEBT/MEBO治療，燒傷后28天，角蛋白19型陽性細胞減少  ×200

圖5-4-1圖5-4-7均為應用小鼠抗人角蛋白19型單克隆抗體于冰凍切片染色(生物素－抗生物素蛋白DSC體系間接免疫熒光)照片。

(徐榮祥， 許增祿)