前言：

目前，科學(xué)家們?cè)诟杉?xì)胞的研究上不斷的獲得成績(jī)，總結(jié)世界的研究報(bào)道，其干細(xì)胞研究方法有三大類(lèi)，其一類(lèi)是胚胎或成體干細(xì)胞體外組織培植移植技術(shù)研究系統(tǒng)；其二類(lèi)是體外胚胎或成體干細(xì)胞的單細(xì)胞培植移植技術(shù)研究體系；其三是體內(nèi)干細(xì)胞原位組織培植技術(shù)研究體系。前兩者的醫(yī)學(xué)目標(biāo)是通過(guò)移植體外培植的干細(xì)胞或組織器官，達(dá)到治療器官組織損傷性疾病的目的；后者是作者發(fā)明建立的技術(shù)研究體系，醫(yī)學(xué)目標(biāo)是通過(guò)激活和調(diào)動(dòng)器官組織原位局部的干細(xì)胞潛能，原位再生組織和器官，直接再生修復(fù)和修補(bǔ)損傷的組織器官，達(dá)到治療器官組織損傷的目的。本報(bào)告專(zhuān)題介紹在深度燒傷創(chuàng)面上如何原位培植表皮角蛋白19型干細(xì)胞的技術(shù)程序情況。敬供大家參考。

什么叫原位干細(xì)胞培植？

原位干細(xì)胞是指：體內(nèi)組織器官局部存在的干細(xì)胞和具有干細(xì)胞潛能的特殊組織細(xì)胞。其特點(diǎn)是存在于成體器官組織中，可轉(zhuǎn)化為更原始和增殖能力的細(xì)胞；可直接在器官組織中再生為具有與原組織相同功能和結(jié)構(gòu)的器官組織；其組織與原有器官組織再生為一體。實(shí)現(xiàn)這一原位組織修復(fù)技術(shù)的技術(shù)稱(chēng)原位干細(xì)胞培植技術(shù)。

材料與方法：

1、 深度燒傷創(chuàng)面：A、干細(xì)胞標(biāo)記實(shí)驗(yàn)創(chuàng)面：下肢深度燒傷；B、臨床重復(fù)創(chuàng)面：面部深度燒傷。

2、 干細(xì)胞標(biāo)記實(shí)驗(yàn)方法：選角蛋白19型表皮干細(xì)胞作為特異陽(yáng)性干細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)方法是用小鼠單克隆抗體放射性免疫熒光技術(shù)。

3、 臨床床技術(shù)：無(wú)損傷液化排除壞死皮膚技術(shù)和創(chuàng)面活組織培養(yǎng)技術(shù)(MEBT)。

4、 細(xì)胞培植物質(zhì)，創(chuàng)面全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(MEBO-2)。

角蛋白19型表皮干細(xì)胞跟蹤：

方法：在皮膚深度即時(shí)燒傷(傷后2小時(shí)內(nèi))，立即取創(chuàng)面深部活組織，和創(chuàng)面周?chē)礋齻麉^(qū)皮膚活組織，低溫冰凍儲(chǔ)存；待進(jìn)行放免組織細(xì)胞的角蛋白19型表皮干細(xì)胞檢查。而后立即行MEBT和MEBO-2治療。分別在第24小時(shí)、第四天、第七天、第十四天、第十七天、第二十一天、第二十八天，取創(chuàng)面下的活組織，方法同上，檢查其角蛋白19型陽(yáng)性的細(xì)胞。

放免檢查及結(jié)果：

傷后立即取組織進(jìn)行組織學(xué)檢查，確定為全厚皮燒傷(年齡大于25歲)才能入選，同時(shí)立即取傷區(qū)活組織和未傷皮膚組織進(jìn)行放免檢查，未查見(jiàn)角蛋白陽(yáng)性的19型表皮干細(xì)胞；傷后24小時(shí)則查見(jiàn)19型表皮干細(xì)胞；第7天開(kāi)始向高峰發(fā)展，第十四天達(dá)高峰；而后逐漸減少，到第二十八天，降到最低點(diǎn)；創(chuàng)面第二十八天基本愈合，真皮、表皮修復(fù)。(見(jiàn)圖)

面部深度燒傷重復(fù)實(shí)驗(yàn)：

1、 面部燒傷半小時(shí)(年齡58歲)，立即取創(chuàng)面活組織檢查為全厚皮壞死；(圖)

2、 立即行MEBT療法，將皮膚耕耘至深部活組織，外涂MEBO-2，使MEBO-2 直接滲入到創(chuàng)面下活組織。(圖)

3、 無(wú)損傷液化排除壞死皮膚層。(圖)

4、 繼續(xù)培養(yǎng)創(chuàng)面活組織，創(chuàng)面下活組織組織學(xué)顯示呈皮膚干細(xì)胞增殖生長(zhǎng)狀態(tài)。(圖)

5、 繼續(xù)培植創(chuàng)面，見(jiàn)與創(chuàng)面基底生理連接的正常結(jié)構(gòu)皮膚從創(chuàng)面中透出。(圖)

6、 繼續(xù)培植50天，面部正常結(jié)構(gòu)的皮膚原位完全再生。(圖)，原位干細(xì)胞原位復(fù)制皮膚完成。

臨床擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)：

原位培植皮膚技術(shù)治療燒傷，在全身系統(tǒng)外科治療的配合下，已成為重要可靠的大面積燒傷治療技術(shù)�，F(xiàn)展示大面積燒傷治療所獲的再生新皮膚的實(shí)體狀態(tài)。(圖)

討論：

原位表皮干細(xì)胞研究實(shí)驗(yàn)論證說(shuō)明

1、角蛋白19型表皮干細(xì)胞：多種研究一致認(rèn)為，人的皮膚中的表皮基底細(xì)胞、毛囊、腺體中均存在表皮干細(xì)胞，有的接近成體細(xì)胞，有的仍具有較原始的分化能力，如毛囊中的干細(xì)胞。從而人們把這些干細(xì)胞按其原始分化能力和角蛋白的表達(dá)類(lèi)型，分多種類(lèi)型。公認(rèn)的事實(shí)，在正常皮膚中，存有小于角蛋白16型的表皮干細(xì)胞。而本課題選定的角蛋白19型表皮干細(xì)胞，是皮膚器官組織胚胎形成中的表皮干細(xì)胞，在皮膚形成成體器官后，表皮干細(xì)胞不再表達(dá)為19型。所以，本課題選角蛋白19型作為表達(dá)檢查干細(xì)胞具有特異性，以區(qū)分其他表皮干細(xì)胞。排除其他表皮干細(xì)胞的干擾。本實(shí)驗(yàn)證明，用同樣的方法檢查未燒傷區(qū)皮膚組織，未查見(jiàn)角蛋白19型表皮干細(xì)胞。以此說(shuō)明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的可靠性。

2、活檢組織處理方法，由于本實(shí)驗(yàn)為原位干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，不能用細(xì)胞傳代的方法進(jìn)行細(xì)胞檢查鑒定，因細(xì)胞傳代則無(wú)法證明原位細(xì)胞的特性，也就是說(shuō)，對(duì)傳代細(xì)胞的鑒定不能代表原位細(xì)胞的鑒定，兩者有質(zhì)的區(qū)別。本實(shí)驗(yàn)采取對(duì)活檢組織立即冰凍、阻止細(xì)胞傳代的方法，有其特異的準(zhǔn)確性；細(xì)胞標(biāo)本真實(shí)；活檢組織的表達(dá)與原位細(xì)胞一致。

原位培植方法說(shuō)明

本實(shí)驗(yàn)采取的是一種在燒傷后直接在活組織原位培植表皮干細(xì)胞的方法，實(shí)現(xiàn)其方法有三個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其一、設(shè)法盡快在燒傷后將干細(xì)胞培養(yǎng)基送到原位；其二、是如何盡快無(wú)損傷清除影響表皮干細(xì)胞再生的壞死皮膚；其三、如何在創(chuàng)面上原位培植干細(xì)胞再生皮膚。這三大技術(shù)是培植原位干細(xì)胞的關(guān)鍵，也是外科醫(yī)生的技術(shù)實(shí)施水平體現(xiàn)。由于這些技術(shù)是專(zhuān)項(xiàng)的臨床應(yīng)用操作技術(shù)，將在另一專(zhuān)題中分別介紹。

MEBO-2的說(shuō)明

MEBO-2是專(zhuān)門(mén)用于培養(yǎng)皮膚的產(chǎn)品，全由營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成，具有激活和誘導(dǎo)具有干細(xì)胞潛能的細(xì)胞增殖的作用，具有調(diào)節(jié)表皮干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞再生增殖的作用；具有創(chuàng)造創(chuàng)面生理微環(huán)境的作用；具有營(yíng)養(yǎng)保護(hù)創(chuàng)面的作用；他是一種由多種天然成分組成的組合物。目前仍在商業(yè)秘密階段。

角蛋白19型表皮干細(xì)胞表達(dá)規(guī)律

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，全厚皮膚燒傷壞死后，殘存于皮下組織中的具有表皮干細(xì)胞潛能的某些組織細(xì)胞，可被激活和誘導(dǎo)成角蛋白19型表皮干細(xì)胞，而新出現(xiàn)的角蛋白19型干細(xì)胞在創(chuàng)面愈合過(guò)程中增殖活躍，在創(chuàng)面修復(fù)的高峰期，其量也達(dá)高峰；而在愈合后期，其量逐漸減少，很可能是19型表皮干細(xì)胞已向成體型細(xì)胞轉(zhuǎn)化，形成組織所至。在組織切片檢查中證實(shí)了這一規(guī)律。關(guān)于角蛋白19型干細(xì)胞被激活和被誘導(dǎo)的機(jī)制及基因表達(dá)研究，也將另行報(bào)道。

原位表皮干細(xì)胞培植技術(shù)的科學(xué)價(jià)值和評(píng)價(jià)

人體皮膚是最大、功能最多、含器官組織最的多的器官，原位角蛋白19型表皮干細(xì)胞的培植成功，不僅給深度燒傷的治療提供了保守治療的新方法，而且給人體原位組織器官的原位干細(xì)胞再生技術(shù)創(chuàng)出了一條新路。但是本實(shí)驗(yàn)僅報(bào)道了表皮干細(xì)胞的培植情況，而皮膚器官中的多種細(xì)胞組織的培植情況尚待繼續(xù)報(bào)道和研究。