[摘 要]：目的：通過(guò)體外檢測(cè)美寶胃腸膠囊（GIC）對(duì)胚胎小白鼠小腸器官型植塊生長(zhǎng)的作用以探索GIC修復(fù)粘膜損傷的機(jī)理。方法：體外培養(yǎng)胚胎小白鼠小腸器官型植塊，并將所有植塊分為兩組：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組的小腸器官型植塊能很好地維持存活，并有大量的單個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞克隆以及片狀粘膜組織塊長(zhǎng)出，生長(zhǎng)的時(shí)間長(zhǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)好；而對(duì)照組的小腸器官型植塊均很快歸于死亡。二者差異極為顯著。結(jié)論：GIC能夠維持胚胎小白鼠小腸器官型植塊的存活，并能促進(jìn)細(xì)胞增殖，某種程度上維持組織的完整性，重新組合成粘膜組織，此結(jié)果可能與GIC激活上皮干細(xì)胞有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]：GIC；小腸植塊；生長(zhǎng)

GIC Could Maintain Survival and Promote Cell Growth of Organ-Type Explants of Intestine of Mouse Embryo Xu rong-xiang,Wang Yan-ping,Fan Ran,etc。

Central laboratory, MEBO Global Group 100053

[Abstract]： Objective: To research on the reparative mechanism of GIC on intestinal lesion through examining the effect of on the survival and cell growth of organ-type explants of intestinal tissue of mouse embryo. Methods: Cultured the organ-type explants of mouse intestinal tissue in vitro, all the explants were divided into two groups: test group and control group. Results: Explants could survive in test group. Single cells, cell clones and tissue pieces could grew out of the explants and grew long and well　in test group. Conclusion: could maintain survival of intestinal explants and promote growth of cells from intestinal explants of mouse embryo and this process may be involved in the activation of epithelial stem cells.

[Key words]： GIC; intestinal explant ;　growth

　　大量臨床實(shí)踐顯示，GIC可能也是通過(guò)激活粘膜上皮干細(xì)胞、促進(jìn)組織細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)理實(shí)現(xiàn)對(duì)損傷粘膜修復(fù)的，為了證明這一觀點(diǎn)，我們特設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)。

　　一. 儀器、設(shè)備、材料、試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

　　培養(yǎng)箱（美國(guó)Forma）、冰箱（江蘇長(zhǎng)嶺）、倒置顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠）、超級(jí)恒溫水浴及恒溫電烤箱（重慶四達(dá)）、超凈工作臺(tái)（北京半導(dǎo)體設(shè)備二廠）、顯微成像分析系統(tǒng)（上�？迫穑�、微波爐（廣東Galanz）、微型計(jì)算機(jī)（北京沐澤）、光學(xué)顯微鏡（江蘇光學(xué)儀器廠）、各種型號(hào)注射器、12孔培養(yǎng)板（丹麥NUNC）、50ml離心管、Eppendorf離心管、微量加樣器（1000μl、200μl、20μl、10μl, 均為法國(guó)Gilson）、大小滴頭、玻璃培養(yǎng)皿（φ5cm、φ6cm）、0.22μm微孔濾膜、針頭濾器、顯微外科器械、各種眼科手術(shù)器械、有蓋三角燒瓶、有蓋小試管、針頭、GIC（美寶公司生產(chǎn)）、MEM培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone）、胎牛血清（杭州三利）、青霉素和鏈霉素（華北制藥）等。

　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明種胚胎小白鼠

　　二. 實(shí)驗(yàn)方法：

　　1．取孕16日齡的昆明雌性小白鼠，頸椎脫臼法處死之，先置于75%乙醇中粗洗一遍（2分鐘），再置于75%乙醇中消毒5分鐘；

　　2．用眼科剪以及止血鉗先剪開(kāi)雌鼠的腹部皮膚，鈍性分離至兩側(cè)，充分暴露腹壁肌肉，然后小心剪開(kāi)腹壁全層，切勿傷及內(nèi)臟及小鼠胚胎；

　　3．剪開(kāi)子宮，從宮腔中取出胚胎鼠，置入無(wú)菌平皿中；

　　4．用雙抗-冷PBS將胚胎鼠體表洗滌兩次，每次１分鐘；

　　5．用顯微外科剪刀將胚胎鼠的腹壁剪開(kāi)，再用顯微外科鑷子夾起鼠近胃端小腸（包括十二指腸和空腸），截�。瞔m左右；

　　6．用雙抗-冷PBS將胚胎鼠小腸連續(xù)洗滌兩次，每次1分鐘；

　　7．用顯微外科剪刀將腸管縱行切開(kāi)，充分暴露粘膜面；

　　8．用雙抗-冷PBS將胚胎鼠小腸連續(xù)洗滌兩次，每次1分鐘；

　　9．將鼠小腸置于含雙抗（青、鏈）的MEM培養(yǎng)液中沖洗2次，每次1分鐘；

　　10．將鼠小腸剪成極小的器官型植塊，大小約1mm×1mm；

　　11．將植塊置于12孔培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中央，每孔5塊，間隔約2mm，布局合理，粘膜面向上，輕輕按壓每塊植塊，使其緊貼培養(yǎng)板的表面；

　　12．沿著培養(yǎng)孔的邊緣，每孔中加入約0.5ml的完全MEM培養(yǎng)液，勿使培養(yǎng)液與植塊接觸；

　　13．將培養(yǎng)板置于37，５％培養(yǎng)箱中預(yù)孵育１.5小時(shí)；

　　14．每孔加完全MEM培養(yǎng)液2ml，輕拿輕放，切勿使植塊飄起，實(shí)驗(yàn)組加GIC；

　　15．實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組同步等量換液，每次去掉原液的1/２左右, 再加入相同量的新鮮MEM培養(yǎng)液；

　　16．用倒置顯微鏡觀察植塊生長(zhǎng)情況，用顯微成像記錄分析系統(tǒng)記錄所觀察的結(jié)果，并用計(jì)算機(jī)保存圖像。

　　三．實(shí)驗(yàn)結(jié)果

　　細(xì)胞培養(yǎng)110天內(nèi)的報(bào)告結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的腸組織植塊在培養(yǎng)之初，均能固定在培養(yǎng)孔中央，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，植塊逐漸脫離培養(yǎng)孔底部平面，游離飄浮于深層培養(yǎng)液中，懸浮的位置仍然靠近培養(yǎng)孔底部，但仍然集中于培養(yǎng)孔中央，少數(shù)位于周邊，植塊的大小和形狀幾乎沒(méi)有變化，但在培養(yǎng)的第１０天左右，組織塊就開(kāi)始變得膨松，然后逐漸裂解為很小的組織塊，并最終成為肉眼不易察覺(jué)的組織塊，這時(shí)在視野中發(fā)現(xiàn)了單個(gè)細(xì)胞以及細(xì)胞克隆。在培養(yǎng)的第２０天，對(duì)照組中的細(xì)胞以及細(xì)胞克隆逐漸死亡，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞依舊生長(zhǎng)良好，單個(gè)細(xì)胞越來(lái)越多，在視野中到處可見(jiàn)，以位于中央部位的最多，細(xì)胞圓形，細(xì)胞核清晰。細(xì)胞呈典型活細(xì)胞狀態(tài)。越向外越少，邊緣幾乎沒(méi)有，細(xì)胞克隆數(shù)也逐漸增多。每個(gè)克隆所含有的細(xì)胞個(gè)數(shù)隨著時(shí)間的推移也越來(lái)越多。上述結(jié)果說(shuō)明含15%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基無(wú)法提供給組織塊合適而充足的營(yíng)養(yǎng)，而GIC作為高級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)基能夠提供給細(xì)胞合理而充足的營(yíng)養(yǎng)，保證了組織和細(xì)胞的活性。

　　下面為培養(yǎng)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的對(duì)比圖譜，可以深刻反映兩組的差別。

圖１　培養(yǎng)第24天。圖1A為對(duì)照組，圖1B為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組中的小腸組織細(xì)胞或細(xì)胞克隆已經(jīng)死亡，實(shí)驗(yàn)組中顯示的是大量單個(gè)的小腸組織細(xì)胞，但其中沒(méi)有克隆。
圖2　培養(yǎng)第30天。圖2A為對(duì)照組，圖2B為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組中為位于視野中央的大量小腸組織細(xì)胞或細(xì)胞克隆已經(jīng)死亡，實(shí)驗(yàn)組中顯示的是即將形成克隆的細(xì)胞。
圖3　培養(yǎng)第38天。圖3A為對(duì)照組，圖3B為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組中的小腸組織細(xì)胞或細(xì)胞克隆已經(jīng)死亡，實(shí)驗(yàn)組中顯示的是一塊較為完整的小腸粘膜組織。
圖4　培養(yǎng)第42天。圖4A為對(duì)照組，圖4B為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組中的小腸組織細(xì)胞或細(xì)胞克隆已經(jīng)死亡，實(shí)驗(yàn)組中顯示的是一塊小腸粘膜組織。