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四．討 論
體外器官型植塊培養(yǎng)，對于檢測控制疾病和健康過程的多種因子有特別的實驗價值，因為在此培養(yǎng)環(huán)境中, 原來在體內(nèi)胃腸道環(huán)境中的各種各樣的刺激物、體液因子、植物神經(jīng)等影響因素皆可一一避免。但由于植塊中上皮細胞之間的聯(lián)系、上皮細胞與間充質(zhì)之間的聯(lián)系以及結(jié)締組織支持框架沒有發(fā)生任何改變，因此，此時觀察激素、藥物、血源性因子以及神經(jīng)遞質(zhì)等因素對粘膜代謝和分泌的直接影響，非常直觀明了，并且能夠允許實驗者直接用來自活體動物的腸粘膜組織進行培養(yǎng)，以觀察粘膜的生理再生、分泌和上皮代謝等重要生理指標。我們采用體外培養(yǎng)法就是為了能夠更直觀地觀察到GIC對細胞生長的直接影響，從細胞水平探討GIC作用的機理。
Yeomans于1976年報道了一種胃組織的體外培養(yǎng)方法 ，他用的是18天齡大白鼠的胚胎胃，快速取胃，刀切均分為三段，近端1/3棄去，
中間1/3為胃底部，遠端1/3為胃竇部，胃竇部及胃底部全層切成極小的碎片（<2mm）。這些植塊粘膜面向上，貼在塑料培養(yǎng)板的底部，水平搖床37 培養(yǎng)3天，設(shè)定搖速，平均約每分鐘使培養(yǎng)液沖洗植塊2次，這是第一種方法。另一種方法是將粘膜放在金屬網(wǎng)格上，然后把粘膜連同網(wǎng)格一起置于多孔培養(yǎng)板中央的孔，其它孔中置入無菌生理鹽水浸泡過的無菌紗布以便保持濕度，蓋好，置入一個密閉容器中，通95%的氧氣和5%的CO2，37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。由于上述體外培養(yǎng)方法目前還沒有適宜的培養(yǎng)基，實驗者維持體外培養(yǎng)的胃粘膜組織存活時間普遍較短，一般很難超過48小時，培養(yǎng)基中如果不加血清，時間更短，6~12小時會退化壞死，盡管他們很注意選用好的培養(yǎng)基（9份DMEM-HEPES加1份NCTC-135，另加10%胎牛血清），但由于植塊存活時間短，給實驗者提供的檢測時間有限，檢測項目不能設(shè)計的太多，太多了做不完，時簡比較倉促，觀察結(jié)果只能觀察那些即刻的實驗結(jié)果，而不能觀察較長時間（或延遲的）才出現(xiàn)的實驗結(jié)果。由于上述方法不能為長時間培養(yǎng)提供穩(wěn)定的培養(yǎng)條件，用這種方法進行體外培養(yǎng)人胃腸道的粘膜，形態(tài)完整性和功能穩(wěn)定性僅能維持6~12個小時，家兔胃粘膜活性組織最多可有24小時的穩(wěn)定生理功能，之后就會出現(xiàn)不可逆漸進性退化直至死亡。
含有GIC的培養(yǎng)基直接打破了現(xiàn)有培養(yǎng)條件的限制，可以長期培養(yǎng)離體胃粘膜組織，便于在光鏡下直接觀察GIC對胃粘膜生長的中長期影響，給粘膜體外培養(yǎng)帶來了一次根本性改變，這在傳統(tǒng)培養(yǎng)基和傳統(tǒng)方法下是不可能實現(xiàn)的。由于使用了含有GIC培養(yǎng)基，作者實現(xiàn)了本實驗的目的，本實驗的主要目的就是觀察GIC對粘膜生長的影響，此結(jié)果也充分體現(xiàn)了GIC對胃粘膜組織的細胞保護作用。
為什么胃粘膜能夠在這種環(huán)境中長期生長呢？可能有兩個原因：一是GIC本身就是具有豐富而全面營養(yǎng)的細胞培養(yǎng)基和良好的細胞保護劑；另一個是胃粘膜組織中有粘膜干細胞，GIC激活了干細胞，促進了干細胞增殖。
對于第一個原因的解釋：
GIC有效成分中含有的亞油酸是細胞必需的脂肪酸，是構(gòu)成細胞生物膜不可缺少的組分，是皮膚、粘膜及深層組織損傷后進行修復(fù)的重要材料。另外GIC有效成分中還含有蛋氨酸、半胱氨酸、精氨酸、亮氨酸等多種氨基酸以及多種脂類物質(zhì)、維生素、微量元素，為胃粘膜細胞生長提供了豐富的營養(yǎng)。有效成分具有抗病原微生物作用，對多種細菌、病毒、真菌、原生物都有較強的抑制作用，同時具有抗炎作用。GIC中的有效成分還可以促進細胞的能量代謝、蛋白質(zhì)及核酸合成和生物膜的轉(zhuǎn)運等功能。GIC中的緩釋劑成分使其緩慢釋放至培養(yǎng)基，防止?jié)舛冗^高或過低，使細胞持續(xù)得到恒定的營養(yǎng) 。
GIC有效成分中的抗氧化作用對長期培養(yǎng)的細胞的存活極為重要，抗氧化表現(xiàn)為抗自由基、穩(wěn)定細胞膜。自由基是廣泛存在于各種化學(xué)反應(yīng)中的活潑基團，倘若其產(chǎn)生過量，從而引發(fā)所謂的自由基鏈式反應(yīng)，則將導(dǎo)致細胞膜多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化，所產(chǎn)生的大量脂質(zhì)過氧化物會損傷細胞膜及細胞內(nèi)的大分子蛋白質(zhì)與核酸，對細胞造成損傷。GIC有效成分中含有大量的維生素E，維生素E的抗自由基功能是由于其自身結(jié)構(gòu)具有還原性，進而捕捉自由基從而阻斷自由基鏈式反應(yīng)，起到對細胞的保護作用，而其自身則經(jīng)過維生素C和含硫氨基酸的再生而還原或轉(zhuǎn)變?yōu)轷惢衔�。大量維生素E的存在可使細胞處于流動性高、通透性嚴密的狀態(tài)。這除了可保護膜上大量的多不飽和脂肪酸不被氧化外，還與其可以保護膜蛋白的活性結(jié)構(gòu)有關(guān)。
對于第二個原因的解釋：
胃粘膜組織中有粘膜上皮干細胞，GIC啟動了干細胞。胃粘膜的上皮組織來源于上皮干細胞（epithelial stem cell）,
用 -胸腺嘧啶脫氧核苷放射自顯影研究顯示，胃粘膜的上皮干細胞位于胃小凹底部至胃底腺頸部的細胞群中 。組織學(xué)顯示胃小凹底部的表面粘液細胞與胃上皮其它部位的同種細胞相比，體積稍小，粘原顆粒較少，分化程度較低，具有旺盛的增殖能力。那些喪失分裂能力的子細胞向小凹上部與粘膜表面不斷移動，最終這些細胞變?yōu)槌墒斓娘柡吃w粒的表面粘液細胞。細胞到達粘膜表面后不久即脫落。新生的細胞從小凹底部開始向上遷移至脫落需要3~4天的時間。這些胃粘膜的干細胞最容易在體外增殖，干細胞屬于未分化細胞，盡管脫離了體內(nèi)生長的微環(huán)境，但仍然具有較強的增殖能力。
至于生長的細胞的性質(zhì)，我們認為就是胃粘膜細胞，主要原因有兩個：一是因為粘膜上皮干細胞在體外有較強的增殖功能，在體外可有一定程度的生長繁殖，這已經(jīng)為許多研究結(jié)果所證實，胃壁其它細胞均不具備這種能力，本實驗所用的胃組織標本中，除粘膜細胞外，數(shù)量最多的應(yīng)該是胃壁的平滑肌細胞，平滑肌細胞在體外只能進行有限的增殖，本實驗完全可以排除平滑肌細胞生長的可能性，因為培養(yǎng)自始至終未曾發(fā)現(xiàn)形態(tài)呈條形或梭形、排列呈束狀的平滑肌細胞生長。再次，目前還沒有發(fā)現(xiàn)平滑肌干細胞，這也被認為是平滑肌在體外不易長期生長的原因之一。其它細胞如粘膜下層疏松結(jié)締組織中的動脈、靜脈、淋巴管、神經(jīng)纖維和粘膜下神經(jīng)叢等組織的細胞能如此生長的可能性很�。坏诙䝼�原因是優(yōu)勢生長的問題，當(dāng)某種細胞特別容易生長的時候，其它細胞的生長就會受到一定程度的抑制或者完全被抑制，本實驗中其它細胞的生長完全可以被胃粘膜細胞旺盛的生長所抑制。
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